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      • 2016版流式細胞儀選購指南[選購寶典]
      • 對于單個細胞及其他生物粒子的分析,流式細胞術已經成為一種不可或缺的方法。它讓研究人員能夠在單細胞水平高效地鑒定關鍵的標志物,如小分子、核酸以及肽段和蛋白。如今,儀器和試劑的創新為研究人員帶來了更多的選擇。如何選擇一臺適合的儀器?在選購中要注意些什么?趕快來看看吧。

        背景

        第一臺商用的流式細胞儀是在1974年推出的。在四十多年的時間里,這臺實驗室主力不斷進化,幫助科學家在大海中撈針,以找到細胞功能的微妙變化。儀器的流體系統、光學系統、標記技術和分析系統都在創新,但流式檢測的目的并沒有變:大型生物顆粒的檢測和定量。

        基本組件

        市場上有各種類型的流式細胞儀,從經典的臺式儀器到當下熱門的便攜式設備,可輕松帶出實驗室。所有儀器都有三個基本組件:流體系統、光學/檢測系統以及分析系統。在此,我們回顧一下這些部件的基本特征,方便你選購下一臺儀器。

        流體系統

        在流式分析中,細胞或顆粒溶液被聚焦成一束,以一定速度從流動室噴嘴中噴出。常見的聚焦機制是流體力學聚焦,其中細胞溶液被鞘液包裹和推動。通過調整鞘液的速度,你可以調整直徑,從而調整單細胞懸液的通量;鞘液速度快,意味著細胞束窄,增加了每次只有一個細胞通過檢測器的可能性。對于高通量藥物篩選或T細胞免疫分型,這很有用。

        在分析更高密度的細胞時,細胞束越窄,意味著通量越低,你需要更長的時間才能獲得結果。讓鞘液減慢,可以提高通量。不過隨之而來的是多個細胞并排通過的可能性增加,或不同細胞通過檢測光束的不同部分,人工降低了某些細胞的信號。因此,在建立操作步驟時,應當優化鞘液的速度。

        聲波聚焦是替代流體力學聚焦的另一種方法,它利用超聲波將細胞置于單個聚焦線上。聲波聚焦有助于確保每次只有一個細胞通過,同時維持比較高的通量。這種技術在尋找稀有細胞時特別有用,比如尋找血液中的循環腫瘤細胞(CTC)。賽默飛世爾的Attune NxT儀器就使用了這種聲波聚焦技術。

        其他一些廠家,包括默克密理博(MUSE和Guava easCyte系統)、美天旎(MACSQuant Tyto)和Cell Signaling Technology(CellSimple)也推出了一些流式儀器,用微流體取代傳統的鞘液。盡管這些儀器在功能上可能沒有高端系統沒有精致,但它們也帶來了強大的細胞或顆粒分析。對于那些經驗或經費有限的實驗室而言,這些系統相當有吸引力。

         

         

         

        光學系統

        一旦細胞被聚焦成一束,它們就要接受光源(通常是激光)的拷問。光的破壞和散射,提供了有關細胞物理性質的信息。一些儀器包含多個激光光源,讓用戶獲得更多數據。

        在許多流式系統中,光的散射以兩種方式被監控。前向散射光(FSC)帶來細胞大小或表面積的信息。較小的細胞折射較少的光,而較大的細胞折射較多的光。第二種是側向散射光(SSC),它提供了細胞復雜度的信息或內部結構的檢測。綜合這兩個測量結果,研究人員可確定多個參數和功能,從而區分不同的細胞類型。

        光散射模式只是提供了細胞的物理信息。若要拷問細胞的分子特征(如基因表達、蛋白定位或細胞周期的狀態),細胞必須經過某種方式的標記。這通常使用熒光染料或熒光標記的抗體或納米顆粒來實現的。

        最近,一些聚合物染料(如BD Biosciences的Horizon和Sirigen試劑)已經出現,它們的亮度比傳統染料亮幾個數量級,讓研究人員能實現更精細的檢測,特別適合稀有細胞。同樣地,不斷增加的氨基活性染料也在幫助研究人員確定和排除死細胞,從而改善分析和分選的質控能力。

        同時,納米顆粒(如賽默飛世爾的Qdot納米晶體)為長時間的實驗帶來了更加一致的熒光,因為它們不會發生光漂白,即使體外實驗變成體內實驗,比如干細胞移植到動物體內,它們也能被監控。

        染料、抗體和納米顆粒的選擇在很大程度上取決于應用和目標。在針對一個非常特異的細胞類型時,如CD4+ T細胞,熒光標記的抗體讓你能精確定量混合物中的這些細胞。不過許多應用并不需要這么精確,比如細胞活力或細胞周期分析。在這種情況下,染料就已經綽綽有余了。

        不同的熒光基團在不同的波長下激發和發射,因此,許多流式細胞儀提供了多個光源(激光器)和發射濾光片。流式儀器中常用的激光器有:藍色(488 nm)、黃綠色(561 nm)、紅色(640 nm)、紫色(405 nm)和紫外光(355 nm)。許多廠商提供不同的濾光片,讓研究人員能夠實現多重檢測,以監控多個標志物。這些實驗的挑戰在于優化熒光標記和現有的激光器,以便盡量減少光譜重疊。

        無論是散射光還是熒光,細胞的光信號都由光電倍增管(PMT)收集,將光強度轉換為電子讀數。在某種程度上,PMT的靈敏度決定了檢測的分辨率 – 你可以檢測的顆;騺喖毎M分有多小,以及你是否能很好地區分鄰近細胞的信號。

        對于某些儀器,特別是提供圖像數據的儀器,PMT已被替換成CCD照相機。這些儀器不僅能提供熒光標記的強度信息,還能提供這些標記在細胞內的精確定位。對那些監控蛋白轉位或細胞信號的實驗而言,這特別有用。

        當然,成像流式細胞儀雖然帶來更多信息,也產生了更大的文件,帶來數據存儲的問題,不過將數據推送到云平臺,可緩解這一問題。此外,分析和處理數據的軟件正在改善,變得更加用戶友好,讓經驗有限的研究人員也能輕松使用。

         

        分選

        在鑒定細胞或顆粒之后,我們通常需要進一步的分析,利用新一代測序(NGS)或數字PCR(dPCR)這樣的技術,或者培養細胞,用于治療等目的。這時,流式細胞儀的分選功能就顯得很重要。

        當細胞流離開檢測光束時,壓電傳感器導致細胞流發生高頻震動,斷成一連串單細胞的液滴。流式細胞儀通常每秒形成1萬至10萬個液滴。事件檢測和液滴形成之間的精確距離被稱為液滴延遲。這是一個關鍵參數,可確保收集的液滴攜帶了觸發事件的細胞。之前,液滴延遲的測定是一個費力的過程,需要多年的訓練。不過最近,這個過程已在一些儀器(如Bio-Rad的S3e和BD Biosciences的FACSAria Fusion)上自動化。

        根據用戶定義的參數,帶電荷的細胞被偏轉到管、板或其他類型的收集容器中。同時,不帶電荷的細胞流進入廢液缸。不同的流式細胞儀采用獨特的方法來捕獲和分選細胞,因此,最適合你的儀器通常取決于樣品類型,以及你的下游應用。許多廠家都提供了可分選細胞的流式系統(見上表)。

        用戶界面和分析系統

        當然,流式分析只是研究人員實現科學目標的手段之一。除非是中心實驗室,你可能不希望調撥一個專門的技術人員來負責流式細胞儀的使用和維護。相反,你需要一臺簡單易用的儀器,只需極少培訓。為了滿足研究人員的需求,供應商開發出適合多個應用的檢測試劑盒。

        此外,許多耗時費力的過程都已經在流式細胞儀上實現了自動化。一些儀器還帶有自我清潔功能和堵塞檢測系統,旨在最大限度減少停機時間。有時,你只需按一下按鈕,就能完成實驗設計,而儀器也提供了許多標準化的操作方案。對于那些日復一日開展相同檢測的實驗室而言,這種儀器可能很適合。

        同樣地,儀器自帶的數據分析工具、商業化的軟件和免費軟件也正變得更簡單,更適合整個機構內的用戶使用。許多軟件包允許用戶調整結果的顯示模式(直方圖或散點圖),分離特定的細胞亞群(設門),改變分析參數(從前向散射 vs. 側向散射到前向散射 vs. 熒光),或生成多孔板的熱圖。

        選購要點

        說了這么多,也許大家有點暈,到底要選購哪一臺呢?請記住,流式細胞儀的基本組件在所有系統上都能找到。選擇哪些特殊功能,這要取決于今天的應用,以及未來的應用。這里有一些小提示,可幫助你選擇合適的流式系統。

        1. 功能性需求。你需要鑒定細胞,還是也需要細胞分選?有些儀器提供一種功能,而有些儀器可提供兩種功能。不同的系統可實現更高水平的分離、鑒定和檢測。

        2. 確定用戶。誰將使用這個系統,他們的經驗如何?儀器、試劑和軟件開發商考慮到不同水平的用戶,他們開發出各種產品,以滿足各種經驗層次的需求。

        3. 多重分析。多重分析的需求將影響到激光器的數量選擇。同時,你也需要花時間來了解一下是否有適當的試劑(如染料和抗體)來檢測你的目標。免費的在線資源Chromocyte提供了流式抗體的選擇指南。

        4. 是否可升級。這個系統的組件(即激光器、檢測器、濾光片和軟件)是否可升級?廠商為他們的客戶提供了許多入門級的選擇,但研究是一個動態的過程,所以你要確保你的系統可隨時改變,滿足實驗室的需求。

        5. 實驗室大小。標準的臺式儀器仍是大多數實驗室的選擇。不過,越來越多的便攜式儀器已經由多個廠商推出,如默克密理博、BD Biosciences、Beckman Coulter、Cell Signaling Technology和美天旎等。

        6. 軟件。廠商一般將軟件和培訓教程與他們的儀器捆綁在一起。另外,多家公司提供更詳細的分析軟件,如FLOWJO。研究人員也可在線獲取許多數據分析工具。

        7. 價格。價格從來都是影響購買決策的首要因素。流式細胞儀的價格相差很大,這要取決于功能和組件的數量。研究人員應當考慮每次運行的總成本,以及細胞分離實驗的開展頻率。你應當將這個費用與在中心實驗室分析樣品的成本進行比較。

        結語

        盡管流式細胞儀已經出現了很多年,但是不光儀器,試劑和軟件都在發展。如今的儀器更加小巧,但卻不影響性能和功能。其他技術也正與流式分析相結合,比如RNA熒光原位雜交(FISH),以及質譜(Fluidigm的CyTOF)。這些進步在單細胞水平拓寬了人們對細胞的了解。過去那個只出現在中心實驗室的儀器正走進更多的實驗室。

        (作者:Randall C. Willis & Peter A. Fung / 生物通編譯)

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